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Metabarcoding

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metagenomics_110x210Metabarcoding 16S - 18S e ITS

Serviço completo podendo começar na extração de DNA e indo até a bioinformática para a listagem de microrganismos presentes e comparação das amostras. São inúmeras as aplicações do metabarcoding, desde o controle ambiental até a bioprospecção.

Para o metabarcoding, temos o serviço completo e econômico, basta nos enviar as amostras e as amplificaremos com um dos pares de primers descritos abaixo de acordo com sua escolha. Possuímos pacotes completos com o sequenciamento de 30mil, 50mil ou 100mil reads PE250 em plataforma Illumina HiSeq2500 mais a bioinformática com gráficos e imagens em alta definição.

Bioinformática básica:

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  1. Processamento dos dados (estatística, conversão de formato, filtragem de clusters com tags não redundantes).
  2. Composição e abundância das espécies
  3. Complexidade de cada amostra (aplha diversity - Dilution Curve, Chao1, Shannon, Rank Abundance)
  4. Diferença de complexidade entre diferentes amostras ( beta diversity, amostras ≥ 2; (Un)weighted Unifrac distance, PCA/PCoA, Sample Clustering)
  5. Fatores de significância responsáveis por diferenças de complexidade entre amostras (KRONA, Clustering based on Species abundance, Phylogenetic tree, Heatmap, Metastats)
  6. Clustering da composição de espécies entre as amostras (amostras ≥ 3)

Entre em contato e peça um exemplo de relatório gerado.

Os dados serão disponibilizados através de servidor FTP, por compartilhamento via cloud storage
(Google Drive) ou gravado em mídia apropriada.

Amostras:

Podemos receber amostras únicas até milhares por vez. Só é necessário o envio de DNA purificado, com fragmentos maiores que 500bp, concentração superior à 20ng/ul (medida no qubit - nanodrop não é recomendado) e volume de ~20ul. Enviar no mínimo 400ng de DNA, recomendado enviar 1ug de DNA ou mais.

Também podemos receber diversos tipos de amostras para a extração de DNA, como solo, frutas, membranas de filtração, etc.

O controle de qualidade é realizado através da amplificação das amostras com os primers escolhidos. As amostras devem amplificar no tamanho esperado, caso contrário serão recusadas. Tentaremos mudar as condições da PCR para conseguir amplificar a amostra, em cada reação utilizamos cerca de 100-200ng de DNA, por isso se faz necessário o envio de uma quantidade maior. Em caso da presença de inibidores, e se o cliente enviar mais que 1ug de DNA, é possível tentar uma etapa de purificação, valor a combinar.

]Primers disponíveis:* ITS1 está localizado entre os genes de rRNA 18S e  5.8S; ITS2 está localizado entre os genes de rRNA 5.8S e 28S.

Alvo
Região
Tamanho do Fragmento
Primer
Sequência do Primer (5' - 3')
Bacterial
16S rDNA
V4 292 bp 515F GTGCCAGCMGCCGCGGTAA
806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT
V3-V4 466 bp 341F CCTAYGGGRBGCASCAG
806R GGACTACNNGGGTATCTAAT
V4-V5 393 bp 515F GTGCCAGCMGCCGCGGTAA
907R CCGTCAATTCCTTTGAGTTT
Archaeal
16S rDNA
V4 288 bp U519F CAGYMGCCRCGGKAAHACC
806R GGACTACNSGGGTMTCTAAT
Eukaryotic
18S rDNA
V4 179 bp 528F GCGGTAATTCCAGCTCCAA
706R AATCCRAGAATTTCACCTCT
V9 131 bp 1380F CCCTGCCHTTTGTACACAC
1510R CCTTCYGCAGGTTCACCTAC
Fungal
ITS*
ITS1 307 bp ITS5-1737F GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
ITS2-2043R GCTGCGTTCTTCATCGATGC
ITS2 386 bp
Alvo
Região
Tamanho do Fragmento
Primer
Sequência do Primer (5' - 3')
Bacterial
16S rDNA
V4 292 bp 515F GTGCCAGCMGCCGCGGTAA
806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT
V3-V4 466 bp 341F CCTAYGGGRBGCASCAG
806R GGACTACNNGGGTATCTAAT
V4-V5 393 bp 515F GTGCCAGCMGCCGCGGTAA
907R CCGTCAATTCCTTTGAGTTT
Archaeal
16S rDNA
V4 288 bp U519F CAGYMGCCRCGGKAAHACC
806R GGACTACNSGGGTMTCTAAT
Eukaryotic
18S rDNA
V4 179 bp 528F GCGGTAATTCCAGCTCCAA
706R AATCCRAGAATTTCACCTCT
V9 131 bp 1380F CCCTGCCHTTTGTACACAC
1510R CCTTCYGCAGGTTCACCTAC
Fungal
ITS*
ITS1 307 bp ITS5-1737F GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
ITS2-2043R GCTGCGTTCTTCATCGATGC
ITS2 386 bp ITS3 GCATCGATGAAGAACGCAGC
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC

* ITS1 está localizado entre os genes de rRNA 18S e 5.8S; ITS2 está localizado entre os genes de rRNA 5.8S e 28S.

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