Os oligonucleotídeos requerem um fosfato 5 'para que a ligação ocorra. Este fosfato pode ser adicionado enzimaticamente usando polinucleotídeo quinase, ou pode ser adicionado quimicamente durante a síntese de oligonucleotídeos. Os oligos fosforilados também são úteis para alterar a susceptibilidade de uma sequência à hidrólise por uma exonuclease, é por isso que as sondas FRET marcadas com um fluoróforo aceitador requerem um fosfato 3 '. Os fosfatos podem ser adicionados na extremidade 5 'e / ou 3' de um oligo.
