Metabarcoding 16S - 18S e ITS
Serviço completo podendo começar na extração de DNA e indo até a bioinformática para a listagem de microrganismos presentes e comparação das amostras. São inúmeras as aplicações do metabarcoding, desde o controle ambiental até a bioprospecção.
Para o metabarcoding, temos o serviço completo e econômico, basta nos enviar as amostras e as amplificaremos com um dos pares de primers descritos abaixo de acordo com sua escolha. Possuímos pacotes completos com o sequenciamento de 30mil, 50mil ou 100mil reads PE250 em plataforma Illumina HiSeq2500 mais a bioinformática com gráficos e imagens em alta definição.
Bioinformática básica:
- Processamento dos dados (estatística, conversão de formato, filtragem de clusters com tags não redundantes).
- Composição e abundância das espécies
- Complexidade de cada amostra (aplha diversity - Dilution Curve, Chao1, Shannon, Rank Abundance)
- Diferença de complexidade entre diferentes amostras ( beta diversity, amostras ≥ 2; (Un)weighted Unifrac distance, PCA/PCoA, Sample Clustering)
- Fatores de significância responsáveis por diferenças de complexidade entre amostras (KRONA, Clustering based on Species abundance, Phylogenetic tree, Heatmap, Metastats)
- Clustering da composição de espécies entre as amostras (amostras ≥ 3)
Entre em contato e peça um exemplo de relatório gerado.
Os dados serão disponibilizados através de servidor FTP, por compartilhamento via cloud storage
(Google Drive) ou gravado em mídia apropriada.
Amostras:
Podemos receber amostras únicas até milhares por vez. Só é necessário o envio de DNA purificado, com fragmentos maiores que 500bp, concentração superior à 20ng/ul (medida no qubit - nanodrop não é recomendado) e volume de ~20ul. Enviar no mínimo 400ng de DNA, recomendado enviar 1ug de DNA ou mais.
Também podemos receber diversos tipos de amostras para a extração de DNA, como solo, frutas, membranas de filtração, etc.
O controle de qualidade é realizado através da amplificação das amostras com os primers escolhidos. As amostras devem amplificar no tamanho esperado, caso contrário serão recusadas. Tentaremos mudar as condições da PCR para conseguir amplificar a amostra, em cada reação utilizamos cerca de 100-200ng de DNA, por isso se faz necessário o envio de uma quantidade maior. Em caso da presença de inibidores, e se o cliente enviar mais que 1ug de DNA, é possível tentar uma etapa de purificação, valor a combinar.
]Primers disponíveis:* ITS1 está localizado entre os genes de rRNA 18S e 5.8S; ITS2 está localizado entre os genes de rRNA 5.8S e 28S.
Alvo |
Região |
Tamanho do Fragmento |
Primer |
Sequência do Primer (5' - 3') |
Bacterial 16S rDNA |
V4 | 292 bp | 515F | GTGCCAGCMGCCGCGGTAA |
806R | GGACTACHVGGGTWTCTAAT | |||
V3-V4 | 466 bp | 341F | CCTAYGGGRBGCASCAG | |
806R | GGACTACNNGGGTATCTAAT | |||
V4-V5 | 393 bp | 515F | GTGCCAGCMGCCGCGGTAA | |
907R | CCGTCAATTCCTTTGAGTTT | |||
Archaeal 16S rDNA |
V4 | 288 bp | U519F | CAGYMGCCRCGGKAAHACC |
806R | GGACTACNSGGGTMTCTAAT | |||
Eukaryotic 18S rDNA |
V4 | 179 bp | 528F | GCGGTAATTCCAGCTCCAA |
706R | AATCCRAGAATTTCACCTCT | |||
V9 | 131 bp | 1380F | CCCTGCCHTTTGTACACAC | |
1510R | CCTTCYGCAGGTTCACCTAC | |||
Fungal ITS* |
ITS1 | 307 bp | ITS5-1737F | GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG |
ITS2-2043R | GCTGCGTTCTTCATCGATGC | |||
ITS2 | 386 bp | |||
Alvo |
Região |
Tamanho do Fragmento |
Primer |
Sequência do Primer (5' - 3') |
Bacterial 16S rDNA |
V4 | 292 bp | 515F | GTGCCAGCMGCCGCGGTAA |
806R | GGACTACHVGGGTWTCTAAT | |||
V3-V4 | 466 bp | 341F | CCTAYGGGRBGCASCAG | |
806R | GGACTACNNGGGTATCTAAT | |||
V4-V5 | 393 bp | 515F | GTGCCAGCMGCCGCGGTAA | |
907R | CCGTCAATTCCTTTGAGTTT | |||
Archaeal 16S rDNA |
V4 | 288 bp | U519F | CAGYMGCCRCGGKAAHACC |
806R | GGACTACNSGGGTMTCTAAT | |||
Eukaryotic 18S rDNA |
V4 | 179 bp | 528F | GCGGTAATTCCAGCTCCAA |
706R | AATCCRAGAATTTCACCTCT | |||
V9 | 131 bp | 1380F | CCCTGCCHTTTGTACACAC | |
1510R | CCTTCYGCAGGTTCACCTAC | |||
Fungal ITS* |
ITS1 | 307 bp | ITS5-1737F | GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG |
ITS2-2043R | GCTGCGTTCTTCATCGATGC | |||
ITS2 | 386 bp | ITS3 | GCATCGATGAAGAACGCAGC | |
ITS4 | TCCTCCGCTTATTGATATGC |
* ITS1 está localizado entre os genes de rRNA 18S e 5.8S; ITS2 está localizado entre os genes de rRNA 5.8S e 28S.