Visão geral de modificações disponíveis

Seu oligo de DNA pode ser equipado com 5 tipos diferentes de inibidores. O inibidor é incorporado ao oligo durante o tempo de síntese de DNA.

• Dabcyl
• TAMRA
• Quenchers
• Black Hole Quencher 1
• Black Hole Quencher 2
• BlackBerry Quencher 3
  Visão geral da compatibilidade de corantes fluorescentes e inibidores.

Propriedades de absorbância de luz Dabcyl e ausência de fluorescência residual. Portanto, Dabcyl é mais comumente usado como um inibidor em sondas de diagnóstico, como Molecular Beacons ™. Um Molecular Beacon ™ é essencialmente uma sonda de hibridização que consiste em um fluoróforo, um inibidor, estrutura de haste e uma sequência de oligonucleotídeo definida complementar àquela do ácido nucleico alvo. No estado inativo, quando a sonda não é hibridizada com sua sequência alvo, a energia de fluorescência do fluoróforo é transferida para o inibidor por um processo de extinção estática. Para que a transferência de energia luminosa ocorra de forma eficiente, o fluoróforo e o supressor devem estar próximos. Este requisito é considerado no design do Molecular Beacons ™. A hibridização da sonda Molecular Beacon ™ com sua sequência alvo resulta na quebra das ligações H, mantendo o fluoróforo e o supressor justapostos, permitindo que eles se separem, resultando em fluorescência.Dabcyl pode ser facilmente introduzido em muitas posições na extremidade 5 ', na extremidade 3', ou internamente substituindo qualquer resíduo dT adequado por Dabcyl-dT. As propriedades de absorção do Dabcyl limitam a gama de corantes que ele pode extinguir, que é restrita àqueles que emitem a 400-550 nm (absorção máxima, 471 nm). No projeto do Molecular Beacons ™, o fluoróforo e o Dabcyl são aproximados o suficiente para permitir que um espectro ligeiramente mais amplo de corantes seja extinto, aumentando assim a versatilidade da molécula de Dabcyl.

As propriedades de absorção de luz de TAMRA e a sobreposição espectral com vários fluoróforos comumente usados ​​- incluindo FAM, HEX, TET e JOE, tornam-no útil como um inibidor para o projeto de sondas duplas marcadas. A utilidade do TAMRA é, no entanto, limitada devido ao seu amplo espectro de emissão, o que reduz sua capacidade de multiplexação. Sua fluorescência intrínseca contribui para o sinal de fundo, potencialmente reduzindo a sensibilidade dos ensaios baseados em TAMRA. Apesar dessas limitações, TAMRA tem sido usado extensivamente no projeto de ensaios baseados em sonda.

As demandas de pesquisas e diagnósticos genômicos modernos, que normalmente estão centradas em torno de uma necessidade cada vez maior de maior sensibilidade do ensaio, levaram ao desenvolvimento de uma série de novos inibidores de tintura. Alguns dos mais conhecidos são os Black Hole Quenchers ™ (BHQs) que foram especificamente otimizados para têmpera baseada em FRET. Por causa da ampla sobreposição espectral coberta por cada corante, a eficiência de extinção é aumentada, quando comparada com moléculas como Dabcyl. Isso, por sua vez, significa que os BHQs como um conjunto de corantes fornecem acesso a uma faixa muito maior de comprimentos de onda para fins de relatório, cobrindo o visível nas regiões próximas do infravermelho do espectro (480-670 nm). Acoplando isso com o fato de que essas moléculas não têm fluorescência de fundo residual (elas são verdadeiras supressoras de escuridão), significa que uma maior escolha de corantes está disponível para uso em multiplexação, levando a uma maior variedade de formulações de sondas.

O BHQ-1 é normalmente usado para resfriar na faixa de 480-580nm e pode ser usado em conjunto com os fluoróforos comumente usados; por exemplo. FAM, TET, JOE, Yakima Yellow e HEX.

O BHQ-2 é usado para extinguir na faixa de 559-670 nm e é mais eficaz na extinção de fluoróforos, como TAMRA, ROX, Cy3, Cy3.5, Cy5 e LC Red 640.

BlackBerry Quencher 650 (BBQ650) é freqüentemente usado para extinguir fluoróforos repórter de comprimento de onda longo. Eles são usados ​​em várias aplicações envolvendo FRET ou têmpera por contrato. BBQ650 é normalmente usado para têmpera na faixa de 550 e 750 nm. Ele pode ser usado em conjunto com os fluoróforos de comprimento de onda longo, como Cy3, Cy5, Cy5.5, TAMRA e Texas Red.

Ao usar uma base de inosina dentro de uma sonda de hibridização, este resíduo pode formar pares de bases com resíduos dA, dC, dG ou dT na fita alvo. As bases de inosina podem ser usadas em vez de oscilações e têm a vantagem de que a sonda de hibridização não é "diluída" pelos componentes de não emparelhamento das oscilações. A desoxiinosina pode ser uma base "inerte", sua presença em uma sequência de oligonucleotídeo não parece perturbar a formação do duplex de DNA nem desestabilizar o duplex.

Independentemente dos efeitos de sequência, a ordem de estabilidade dos pares de bases é I-C >> I-A> I-T = I-G.

As bases de inosina estão disponíveis em qualquer posição em um oligonucleotídeo e podem ser usadas várias vezes dentro de uma sequência.

Tiolação pode ser usada para introduzir a possibilidade de acoplamento específico a um ligante contendo sulfidrila através de uma ponte dissulfeto. O grupo tiol terminal permite a ligação de um oligo a vários ligantes, tais como biotina, fosfatase alcalina ou corantes fluorescentes, através de maleimida, iodeto, brometo ou derivados de sulfonil. Além disso, o grupo tiol terminal permite a ligação de um oligo a superfícies sólidas por meio de uma ligação iodoacetamida ou maleimida. A modificação de tiol pode ser colocada na extremidade 5 'ou 3' do oligonucleotídeo.

Tiol-Modificador C3 S-S

O grupo tiol é protegido por uma ligação dissulfato após a síntese do oligo e deve ser desprotegido por um agente redutor antes do uso. O agente redutor deve ser completamente removido imediatamente antes do oligo ser usado em uma reação de acoplamento. O DTT é mais comumente empregado como agente redutor.

1 - Clivar a ligação dissulfeto a 37 ° C em DTT (100 mM, pH 8,3) por aproximadamente 30 min;

2 - Dessalinize o oligo em uma coluna;

3 - Os oligos modificados com tiol que foram desprotegidos devem ser mantidos sob uma atmosfera inerte ou em uma solução contendo DTT (10 mM) para evitar a formação de dissulfeto oxidativo;

4 - O DTT deve ser removido completamente por extração com acetato de etila ou por dessalinização antes de usar o oligo;

5 - A Biolegio usa 3'-Thiol-Modifier C3 S-S CPG para a marcação 3', e Thiol-Modifier C6 para a marcação 5'-